Análisis Del ADN

El ADN en la Ciencia Forense

La mayoría de las células que componen el cuerpo humano son células diploides con un ADN idéntico, a excepción de los gametos haploides (óvulo y esperma) y los glóbulos rojos (que no tienen núcleo). En la ciencia forense se utilizan habitualmente varios tipos de pruebas biológicas para el análisis del ADN, como la sangre, la saliva, el semen, la piel, la orina y el cabello, aunque algunos son más útiles que otros. El uso de pruebas biológicas en el análisis genético y de ADN varía, con áreas de estudio que incluyen la tipificación de la sangre, la determinación del sexo basada en el análisis cromosómico (cariotipo), el perfil de ADN y, más recientemente, el fenotipo de ADN forense. Desde la aparición de los perfiles de ADN en la década de 1980, se han utilizado con éxito en casos penales, en la identificación de víctimas de catástrofes y en las pruebas de paternidad, por citar algunos ejemplos. Sin embargo, a pesar de sus méritos, las huellas de ADN no se utilizan idealmente como única prueba en un caso, y en algunos países, como el Reino Unido, las huellas de ADN deben presentarse junto con otras pruebas.

Estructura y función del ADN

Es fundamental comprender la estructura y la función del ADN y su relación con el análisis de ADN en la ciencia forense. El ADN, ácido desoxirribonucleico, es una molécula dispuesta en una doble hélice, cuya estructura fue descrita por primera vez por James Watson y Francis Crick en 1953. Se compone de moléculas de trisfosfato de nucleótidos, denominadas «bloques de construcción» del ADN. Estas moléculas están formadas por un grupo trisfosfato, un azúcar desoxirribosa y una de las cuatro bases nitrogenadas. Las cuatro bases que intervienen en una molécula de ADN son la adenina y la guanina (purinas) y la timina y la citosina (pirimidinas). Estas bases se unen al azúcar de desoxirribosa y a una de las otras bases para formar pares de bases, con la adenina y la timina unidas mediante dos enlaces de hidrógeno, y la guanina y la citosina unidas con tres enlaces de hidrógeno.

El ADN es esencialmente la molécula que contiene toda la información genética y las «instrucciones» de un organismo. El genoma humano está compuesto por más de 3.000 millones de pares de bases de información organizados en 23 cromosomas. Los genes son las regiones del ADN que codifican y regulan la síntesis de proteínas, aunque esto sólo afecta al 1,5% de todo el genoma. Una parte importante del genoma humano, aproximadamente el 75%, consiste en ADN extragénico, que contiene regiones que no contienen secuencias genéticas conocidas. Alrededor del 50% del ADN extragénico está formado por algo llamado ADN repetitivo, que es de especial utilidad en el análisis forense del ADN. El ADN repetitivo se subdivide a su vez en repeticiones en tándem (incluyendo el ADN satélite, los microsatélites y los minisatélites) y las repeticiones intercaladas (SINE, LINE, LTR y Transposon). El ADN de las repeticiones en tándem y la variación entre ellas (polimorfismos) es el objetivo de muchas técnicas de análisis de ADN. Debido al número y la ubicación de estos polimorfismos, cada individuo tiene un ADN único que produce un patrón de bandas distintivo cuando se analiza.

Gracias al amplio estudio del genoma, las huellas de ADN se han convertido en una técnica útil y fiable en la ciencia forense.

Fuentes de pruebas de ADN y extracción de ADN

En lo que respecta al análisis forense del ADN, existen diversas fuentes posibles de pruebas de ADN. Las fuentes más útiles son la sangre, el semen, el flujo vaginal, las secreciones nasales y el cabello con raíces. En teoría, es posible obtener ADN de pruebas como la orina, las heces y las células muertas de la piel, aunque esto se suele clasificar como una fuente deficiente debido a la falta de células intactas y a los altos niveles de contaminantes que impiden un análisis satisfactorio. Dichas muestras se recogerán en función del tipo de muestra (para más detalles sobre la recogida y la conservación de pruebas, véase la página sobre el lugar del delito).
Antes del análisis, será necesario extraer el ADN de la muestra. Esto se consigue generalmente mediante los siguientes pasos simplificados.

  • Las células de la muestra se lisan (descomponen) en una solución tampón.
  • Las proteínas y las grasas desnaturalizadas se separan mediante centrifugación.
  • A continuación, el lisado despejado se hace pasar por una columna, que suele contener un medio cargado positivamente que se une al ADN.
  • Las proteínas, grasas y sales contaminantes se eliminan mediante varios lavados.
  • El ADN se recupera en una solución tampón/agua.
  • La cantidad de ADN se suele cuantificar mediante técnicas espectrofotométricas.
  • Se han ideado varios métodos de extracción para diferentes tipos de muestras.

Las muestras de ADN para la comparación se recogen generalmente de los sospechosos mediante hisopos bucales, en los que se raspa un hisopo estéril a lo largo del interior de la mejilla para recoger células epiteliales que se utilizarán para producir una huella de ADN. Sir Alec Jeffreys es descrito a menudo como el padre de las huellas de ADN.

Polimorfismos de un solo nucleótido

El uso del análisis de ADN en la ciencia forense se basa en una serie de técnicas centradas en los polimorfismos, que se refieren esencialmente a la variación de las secuencias. Se estudian diferentes secuencias en diferentes técnicas, incluyendo los polimorfismos de un solo nucleótido, los minisatélites (repeticiones en tándem de número variable), los microsatélites (repeticiones cortas en tándem) y el ADN mitocondrial, cada uno de ellos diferente en cuanto a longitud y repetición.
Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son el tipo más simple y común de variación genética, y componen alrededor del 90% de la variación genética en los seres humanos. Se producen durante la meiosis cuando el ADN se replica, y cada SNP representa una diferencia en un solo nucleótido. Por ejemplo, un SNP puede sustituir la citosina por una timina en un tramo de ADN, y esto no cambiará la longitud del ADN. Hay unos 10 millones de SNP en el genoma humano, con uno cada 100-300 pares de bases. Estos pueden actuar como marcadores biológicos.

En el análisis de los SNP, que pueden constar de hasta cuatro alelos, debe establecerse la base específica presente en el SNP. Esto se consigue mediante técnicas de secuenciación del ADN. Sin embargo, la secuenciación del ADN no se utiliza generalmente en la ciencia forense, excepto en el análisis del ADN mitocondrial.

Método Dideoxy

También conocido como método Sanger, esta forma de secuenciación del ADN fue desarrollada por Fred Sanger en 1975. Se utiliza un cebador marcado para iniciar la síntesis del ADN. Se añaden cuatro nucleótidos dideoxi y se detiene la síntesis al azar. Se producen fragmentos que se separan posteriormente mediante electroforesis o, en sistemas automatizados más modernos, electroforesis capilar. A continuación, se utiliza un software especializado para convertir los patrones de bandas en una secuencia de ADN. Al principio se utilizaban etiquetas radiactivas inestables y peligrosas, que pronto se sustituyeron por tintes de fluorescencia. Sin embargo, la movilidad variable de estos tintes de diferentes colores hacía que el orden de las bandas no representara necesariamente el orden de la secuencia de nucleótidos. Además, los tintes se comportaban a veces de forma imprevisible, lo que los hacía poco fiables y no especialmente idóneos para su uso en casos forenses. Si las condiciones eran inadecuadas para la plantilla de ADN o los nucleótidos dideoxi, la reacción no tenía éxito. El propio programa informático era problemático, ya que los picos se solapaban a menudo, lo que dificultaba establecer el orden correcto de los nucleótidos.

Minisatélites o repeticiones en tándem de número variable (VNTR)

Las repeticiones en tándem de número variable (VNTR) son secuencias altamente polimórficas en la región de los exones del ADN que se repiten en varios puntos a lo largo del cromosoma, entre 4 y 40 veces. Tienen una longitud de entre 20 y 100 pares de bases, aunque sus longitudes específicas no están estrictamente definidas. Estas repeticiones en tándem se heredan de ambos progenitores, por lo que nadie tendrá las mismas VNTR que cualquiera de sus padres. El número de repeticiones en el locus afecta a su posición tras la electroforesis y a la longitud del ADN después de cortar el cromosoma con una enzima de restricción. Los minisatélites fueron el primer tipo de polimorfismo que se utilizó en una investigación criminal en el caso del asesino y violador británico Colin Pitchfork.

Sin embargo, los VNTR no se suelen utilizar en la investigación forense, ya que esta técnica suele ser un proceso más caro y lleva más tiempo debido a que los VNTR tienen una longitud mayor que, por ejemplo, los STR.

Microsatélites o repeticiones cortas en tándem (STR)

Las repeticiones cortas en tándem (STR) son regiones del genoma compuestas por aproximadamente 1-5 bases y repetidas hasta 17 veces. Los marcadores STR pueden ser simples (repeticiones de longitud idéntica), compuestos (dos o más repeticiones adyacentes) o complejos (varias repeticiones de longitud diferente). Se encuentran en los 22 cromosomas autosómicos y en los cromosomas sexuales X e Y, aunque los del cromosoma Y difieren menos debido a la falta de recombinación. Sólo un número selecto de marcadores de STR se utiliza en los perfiles forenses de ADN (10 en el Reino Unido y 13 en EE.UU.) y expresan un alto grado de polimorfismo, lo que los hace especialmente útiles para los científicos forenses. La variabilidad de los STR se debe a la imprecisión de la ADN polimerasa al copiar la región. Como las regiones de los STR no son codificantes, no hay presión selectiva contra la elevada tasa de mutación, lo que da lugar a una gran variación entre diferentes personas.

Aunque se han encontrado miles de repeticiones cortas en tándem en el genoma humano, sólo un pequeño número se utiliza en el análisis forense del ADN. Los STR utilizados en la ciencia forense tienden a ser repeticiones de tetra y pentonucleótidos, ya que son robustos, sufren menos degradación ambiental y proporcionan un alto grado de datos sin errores. Los loci STR son ideales para su uso en la ciencia forense por varias razones. Representan alelos discretos que se pueden distinguir entre sí, muestran un gran poder de discriminación, sólo se requiere una pequeña cantidad de muestra debido a la corta longitud de los STR, la amplificación por PCR es robusta y se pueden utilizar múltiples PCR, y hay bajos niveles de formación de artefactos durante la amplificación. Uno de los primeros usos de los microsatélites es la identificación del médico del campo de Auschwitz Josef Mengele.

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

Los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) fueron la primera técnica desarrollada para analizar las longitudes variables de los fragmentos de ADN producidos por la digestión del ADN. Aprovecha las variaciones en las secuencias de ADN debidas a las diferentes localizaciones de los sitios de las enzimas de restricción. El método utiliza endonucleasas de restricción para «digerir» el ADN cortándolo en patrones de secuencia específicos. Los fragmentos de restricción resultantes se separan mediante electroforesis en gel y se transfieren a una membrana mediante la técnica de Southern Blot. Una vez transferidos los fragmentos de ADN separados, se utiliza la hibridación con sonda para detectar los fragmentos.

Sin embargo, el análisis de ADN con RFLP requería cantidades relativamente grandes de ADN y las muestras degradadas no podían analizarse con precisión. Se han desarrollado técnicas de análisis de ADN más eficaces, rápidas y baratas, por lo que el RFLP ya no se utiliza en la ciencia forense.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La cantidad de pruebas de ADN obtenidas durante la investigación de un delito suele ser muy pequeña, por lo que para realizar con éxito un perfil de ADN lo ideal es recurrir a alguna forma de amplificación. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite la amplificación exponencial de fragmentos de ADN hasta longitudes de aproximadamente 10.000 pares de bases. Esto significa que, en teoría, una sola copia de un fragmento de ADN podría amplificarse hasta alcanzar millones de copias en sólo unas horas. La PCR es especialmente beneficiosa para la amplificación de cantidades mínimas o de muestras degradadas.

Una reacción de PCR satisfactoria requiere una serie de componentes primarios vitales. Los cebadores de oligonucleótidos, que son complementarios a la diana de ADN y marcan la diana que se va a amplificar, y se utilizan dos cebadores. La secuencia de bases de un cebador se une a un lado de la diana, mientras que el otro cebador se une al otro lado de la diana, amplificándose el ADN entre los cebadores. A menudo se añaden etiquetas fluorescentes a los cebadores para visualizar el ADN amplificado en la electroforesis. La enzima ADN polimerasa permite copiar la cadena de ADN añadiendo nucleótidos al extremo 3′ de los cebadores. Otros componentes necesarios son un tampón de reacción con MgCl para garantizar las condiciones ideales para el funcionamiento de la enzima ADN polimerasa, desoxirribonucleótidos para construir la molécula de ADN y ADN molde. La PCR moderna utiliza polimerasas de ADN termoestables. La más utilizada es la polimerasa Taq, que ha sustituido en gran medida a la polimerasa derivada de E. coli utilizada anteriormente. Esta fue aislada de Thermus aquaticus, que es un organismo capaz de sobrevivir a temperaturas superiores a los 70oC. Sin embargo, la Taq polimerasa carece de la capacidad de lectura de prueba. La polimerasa VENT procede de Thermococcus litoralis, que puede sobrevivir a temperaturas superiores a los 100oC.

El ciclo de la PCR consta de tres pasos principales: desnaturalización, recocido y extensión. El proceso se lleva a cabo generalmente en un pequeño tubo de centrífuga de plástico con la temperatura cuidadosamente controlada utilizando un termociclador.

  • Desnaturalización: La muestra se calienta a 94-95oC durante unos 30 segundos. Esto separa el ADN de doble cadena rompiendo los enlaces de hidrógeno, permitiendo el acceso de los cebadores.
  • Recalentamiento: La muestra se mantiene a 50-65oC, dependiendo de la secuencia del cebador, para permitir que se formen enlaces de hidrógeno entre los cebadores y la secuencia de ADN complementaria.
  • Extensión: También conocida como etapa de elongación. La muestra se calienta a 72oC durante un tiempo que depende de la longitud de la cadena de ADN que se va a amplificar y de la velocidad de la enzima polimerasa (Taq polimerasa) que construye la cadena. Los desoxinucleótidos trifosfatos se añaden al extremo 3′ del cebador.

Cada ciclo de PCR puede durar sólo 5 minutos. Este procedimiento puede repetirse según sea necesario hasta que la secuencia original se haya amplificado una cantidad suficiente de tiempo, duplicándose la cantidad con cada ciclo. Tras la PCR, los productos se separan mediante electroforesis.

Lamentablemente, la PCR no es adecuada para el análisis de cadenas de ADN más largas, por lo que no puede utilizarse con técnicas anteriores como el RFLP. Hay que tener en cuenta que ciertos compuestos pueden inhibir las reacciones de la PCR, a menudo sustancias asociadas a las etapas de extracción y purificación del ADN. Entre estas sustancias se encuentran la proteinasa K (que degrada la enzima polimerasa), los detergentes iónicos y los colorantes de carga del gel. Asimismo, algunas sustancias presentes en la sangre pueden inhibir la PCR, como la hemoglobina y la heparina.

Se han realizado diversas modificaciones para mejorar el método de la PCR. La reacción en cadena de la polimerasa multiplex implica la amplificación de numerosas secuencias de ADN en una sola reacción mediante el uso de cebadores que producen tamaños de alelos no superpuestos, lo que permite analizar simultáneamente numerosas regiones de una muestra.

Errores de la PCR

Varios factores pueden contribuir a los errores e inexactitudes en los datos producidos por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa. La PCR se lleva a cabo a menudo utilizando polimerasas de ADN como la Taq ADN polimerasa, que no tiene la capacidad de «lectura de prueba», lo que da lugar a errores en la amplificación. Cuanto mayor sea la amplificación, más probable será que se produzcan estos errores. El cebado erróneo también es un problema potencial, ya que se forman productos a partir de sitios no objetivo. Pueden formarse excesivos dímeros de cebadores, que son subproductos de la PCR producidos cuando un cebador se anuda a otro provocando la extensión del cebador. Todo esto puede dar lugar a una variabilidad inesperada en el éxito de la PCR en una serie de muestras o a que fallen las condiciones que anteriormente habían tenido éxito.

Electroforesis

Como ya se ha mencionado, durante el análisis del ADN los fragmentos individuales de ADN pueden separarse mediante electroforesis para producir la «huella dactilar de ADN» distintiva. La electroforesis es esencialmente un método de separación de moléculas por su tamaño mediante la aplicación de un campo eléctrico, que hace que las moléculas migren a una velocidad y distancia que dependen de su tamaño. En la electroforesis en gel se utiliza una matriz de gel porosa, que suele consistir en un gel de agarosa para trabajos sencillos o en un gel de poliacrilamida para procedimientos más específicos. El gel suele flotar en una solución tampón para garantizar el mantenimiento del nivel de pH y la conducción de la corriente eléctrica aplicada. Las muestras que se van a analizar se colocan en pequeños pozos en la parte superior del gel utilizando pipetas. A menudo, se ejecutan simultáneamente una muestra de control y una muestra estándar/marcadora. Cuando se aplica la corriente eléctrica, los fragmentos de ADN cargados negativamente comienzan a moverse a través del gel hacia el ánodo cargado positivamente. El gel actúa esencialmente como un tipo de tamiz molecular, permitiendo que las moléculas más pequeñas viajen más rápido que los fragmentos más grandes. Tras la electroforesis, puede ser necesario visualizar estas bandas utilizando sondas o colorantes radiactivos o fluorescentes. La electroforesis no sólo separa el ADN, sino que también permite medir los fragmentos, a menudo expresados en pares de bases. La medición de la longitud de estos fragmentos puede permitir, en última instancia, determinar el número de repeticiones y, por tanto, el genotipo en ese locus.

En las técnicas anteriores se utilizaba la electroforesis en gel de cama plana, aunque ahora se utiliza con más frecuencia la electroforesis capilar, más rápida y automatizada. En esta técnica, abreviada como CE, el gel se mantiene en un tubo capilar fino por el que pasa el ADN marcado con fluorescencia de forma similar a la electroforesis en gel, a menudo con un estándar de tamaño de ADN añadido. A lo largo del capilar hay un rayo láser que provoca la fluorescencia del ADN a su paso. Esto puede ser detectado y enviado directamente a un sistema informático en forma de electroferograma. Lamentablemente, la electroforesis capilar no puede separar más de una muestra a la vez, aunque se puede utilizar un analizador genético para separar una serie de muestras una tras otra.

Técnicas de blotting

Tras la electroforesis en gel, se suelen utilizar sondas para detectar moléculas específicas. Sin embargo, dado que las sondas no pueden aplicarse directamente al gel, inicialmente se utilizaron métodos de blotting. Hay una serie de técnicas de blotting comunes: Southern Blot, Western Blot, Northern Blot, Eastern Blot y Southwestern Blot.

  • Southern Blot – Se utiliza en el análisis del ADN. El ADN se extrae, se separa con electroforesis y se transfiere a la membrana. Se añaden sondas marcadas que se hibridan con secuencias específicas y las identifican.
  • Western Blot – Se utiliza para detectar proteínas. Se utiliza SDS-PAGE para separar las proteínas, que se transfieren a la membrana. A continuación se añaden anticuerpos específicos, seguidos de un sustrato para visualizar las bandas.
  • Northern Blot – Se utiliza para estudiar la expresión de los genes. Es similar al Western blot, salvo que se analiza el ARN.
  • Eastern Blot – Se utiliza para estudiar las proteínas. Se considera una extensión del Western blot.
  • Southwestern Blot – Combina características del Southern y del Western blot. Se utiliza para la caracterización rápida de las proteínas que se unen al ADN y sus sitios.

Análisis de ADN con bajo número de copias (LCN)

El análisis de ADN con bajo número de copias, denominado LCN, es una técnica desarrollada por el Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido en un intento de aumentar la sensibilidad de los métodos de elaboración de perfiles de ADN. Las muestras que contienen pequeñas cantidades de ADN muy degradado suelen dar lugar a problemas como huellas dactilares de baja calidad o incluso resultados completamente negativos. Esta técnica reduce estos problemas.

Desarrollada en 1999,LCN es esencialmente una extensión de la técnica Multiplex Plus de Segunda Generación (SGM+), y se utiliza generalmente cuando la técnica anterior ha fallado o ha producido resultados débiles. La mejora de la sensibilidad se consigue gracias a un mayor número de ciclos de PCR, ya que las técnicas estándar suelen utilizar 28 ciclos, mientras que la LCN utiliza 34. Esto podría permitir, en última instancia, obtener con éxito perfiles de ADN a partir de cantidades mínimas de muestra e incluso de células individuales (véase más adelante).

Sin embargo, la mayor sensibilidad de esta técnica de elaboración de perfiles de ADN hace que aumenten las preocupaciones sobre la facilidad de contaminación y amplificación de estos contaminantes, la elaboración de perfiles mixtos y las acusaciones erróneas. Con técnicas como la LCN, ahora es más importante que nunca que los investigadores lleven ropa de protección adecuada y sigan estrictos procedimientos anticontaminación, y que se utilicen controles en los análisis.

En 2007, la LCN fue objeto de un gran escrutinio a través del caso R contra Hoey, que llevó a prohibir temporalmente el uso de esta técnica hasta que se pudiera llevar a cabo una revisión exhaustiva. Sean Hoey fue juzgado por su participación en el atentado de Omagh en 1998, acusado de numerosos cargos de asesinato, además de los de terrorismo y explosivos. Las pruebas de ADN utilizadas en su contra se basaban en la técnica LCN, relativamente nueva, que en aquel momento sólo se utilizaba en los tribunales británicos. Sin embargo, debido a la falta de datos y a los porcentajes de error conocidos de la técnica, se plantearon serias dudas. Posteriormente, Hoey fue declarado inocente.

Huellas de ADN unicelulares

El análisis de ADN unicelular está estrechamente relacionado con el análisis de LCN. El Dr. Ian Findlay y sus colegas del Centro Australiano de Investigación del Genoma informaron por primera vez del éxito del desarrollo de una huella de ADN a partir de una sola célula en 1997. Se aislaron 226 células bucales de cuatro individuos mediante micromanipulación y se amplificaron utilizando el ensayo Multiplex de Segunda Generación (SGM) del Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido para aumentar la sensibilidad. Se amplificaron seis marcadores STR y la amelogenina para la determinación del sexo. Los resultados del análisis unicelular se compararon con perfiles de ADN conocidos. Mientras que sólo se obtuvo un perfil completo y correcto en el 50% de las pruebas unicelulares, el 91% de las pruebas mostraron algún tipo de resultado.

Los métodos anteriores de toma de huellas de ADN solían requerir cientos de células para obtener un perfil. La célula única se obtiene mediante un hisopado del material y la identificación de la célula que se va a analizar mediante microscopía antes del análisis. Esta técnica es especialmente rápida, ya que se realiza en cuestión de horas, y tiene una especificidad de aproximadamente 1 entre diez mil millones.

El análisis del ADN unicelular es especialmente útil en los casos de violación, ya que el ADN de los espermatozoides está muy conservado al estar tan compactado en la cabeza de la proteína. La técnica también tiene potencial para su uso en documentos. El ADN humano puede colocarse en documentos como bonos del Estado, testamentos y documentos de seguridad, para seguir su curso. Sin embargo, el principal problema de este uso concreto es que los familiares cercanos pueden manipular los documentos, sobre todo cuando se trata de documentos como los testamentos, por lo que la técnica puede no ser apropiada. El análisis de ADN unicelular también es ideal en los procedimientos de fecundación in vitro, en los que se pueden analizar células individuales para detectar defectos genéticos.

Sin embargo, este método plantea algunos problemas importantes. Dado que se requiere un mayor número de ciclos de PCR para amplificar el ADN, esto conlleva problemas de caída de alelos, donde se añaden alelos adicionales a la muestra. El abandono de alelos es un problema similar cuando se aumentan las muestras de amplificación. Cuando se empieza con una sola célula o una pequeña cantidad de muestra, cualquier contaminante ya presente en la muestra será amplificado. Del mismo modo, cualquier inhibidor de la PCR presente estará más concentrado, causando problemas de amplificación. Una de las principales preocupaciones es la facilidad de contaminación por células de otros individuos. Esto podría dar lugar a que las muestras se contaminen y se vuelvan inútiles o, lo que es peor, en el caso de los forenses, que se acuse erróneamente a personas inocentes. Es necesario seguir trabajando para validar la técnica, sobre todo para utilizarla en la ciencia forense.

El trabajo en el análisis de ADN unicelular llevó al Servicio de Ciencias Forenses del Reino Unido a desarrollar el análisis de ADN de bajo número de copias.

ADN mitocondrial (ADNmt)

El ADN mitocondrial es una molécula circular de ADN de 16.569 pares de bases, denominada por primera vez secuencia de Anderson, que se obtiene del orgánulo mitocondrial que se encuentra en las células. Este orgánulo participa en la producción de energía celular. En una célula puede haber entre 100 y 1000 mitocondrias, cada una de las cuales contiene numerosas copias del genoma mitocondrial. Esta secuencia es totalmente funcional y está muy conservada, por lo que hay muy poca variación entre individuos. Sin embargo, hay un bucle D no codificante de 1000 pares de bases, conocido como región de control, que contiene dos regiones hipervariables denominadas HV1 y HV2. Las variaciones dentro de estas regiones suelen ser polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Los SNP no alteran la longitud del ADNmt, y son estas regiones en las que se centra el análisis forense del ADN mitocondrial. El ADN mitocondrial suele estar sujeto a una tasa de mutación relativamente alta debido a su falta de reparación del ADN, lo que provoca variaciones entre los individuos. La variación dentro de esta pequeña porción no es en sí misma especialmente significativa, con HV1 y HV2 que difieren en un 1-3% entre individuos no relacionados.

En el análisis del ADN mitocondrial, se extrae el ADN y se amplifican las regiones HV1 y HV2 mediante PCR. A continuación, se establece la secuencia de pares de bases de estas regiones mediante la secuenciación del ADN (véase la sección de secuenciación del ADN). A continuación se compara con la secuencia de referencia de Cambridge y se anotan las diferencias. También se pueden analizar otras muestras y hacer comparaciones para establecer posibles similitudes. El ADN mitocondrial se utiliza generalmente cuando otros métodos, como el análisis de STR, han fallado. Esto ocurre a menudo en el caso de cadáveres muy degradados, en casos de catástrofes o accidentes en los que un individuo está demasiado dañado para ser identificado, y a veces en taxonomía para determinar las especies utilizando el gen del citocromo b.

La ventaja más significativa del uso del ADN mitocondrial es la posibilidad de analizar incluso muestras muy degradadas. Si un espécimen está muy descompuesto hasta el punto de que no es posible extraer con éxito un perfil de ADN utilizando el ADN nuclear, puede ser posible mediante el ADN mitocondrial. Además, sólo se requiere un tamaño de muestra muy pequeño.

Sin embargo, el uso del ADNmt tiene sus desventajas. Como el ADN mitocondrial sólo se hereda por vía materna, no puede formar una huella dactilar completa del individuo, por lo que esta técnica sólo es beneficiosa si se dispone de los perfiles de ADN de los parientes maternos, como la madre del individuo o sus hermanos biológicos. Por ello, el ADNmt es mucho menos discriminatorio que, por ejemplo, las repeticiones cortas en tándem. Además, la detección de las diferencias de secuencia es relativamente lenta y costosa.

Fenotipado forense del ADN

Se ha intentado utilizar el análisis de ADN para identificar características fenotípicas como el color de la piel, el color del pelo y el color de los ojos en un estudio conocido como fenotipado forense del ADN (FDP) o perfil fenotípico. Para ello se suelen utilizar los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en lugar de los STR. Los SNP tienen una menor tasa de mutación y, por tanto, es más probable que se fijen en una población, por lo que suelen ser específicos de una población. Puede ser posible estimar el origen étnico basándose en la presencia de SNPs o STRs raros vinculados a determinados grupos de población, aunque esta teoría se vuelve problemática con individuos de ascendencia mixta.

La mayor parte de los trabajos sobre los SNP del fenotipo se han centrado en la pigmentación, y los SNP de una serie de genes de la pigmentación se han asociado a diversos fenotipos humanos del cabello, la piel y el color de los ojos.

Ya se están realizando avances en este ámbito de estudio. El Servicio de Ciencias Forenses ha desarrollado un ensayo de tipificación de SNP que incluye mutaciones en el gen del receptor humano de la melanocortina 1 (MC1R), asociado al cabello rojo. Los alelos específicos de este gen se asocian con el pelo rojo, por lo que un individuo que hereda este alelo de cada uno de sus padres tiene una alta probabilidad de ser pelirrojo. Establecer que un individuo es probable que sea pelirrojo es limitado en la ciencia forense, ya que el pelo rojo no es especialmente común, aunque sí lo es en ciertas poblaciones.

Se han llevado a cabo algunas investigaciones sobre la genética del color de los ojos, concretamente en relación con el gen OCA2 del cromosoma 15, que también interviene en la pigmentación de la piel y el cabello. IrisPlex es una prueba desarrollada recientemente que permite predecir con precisión el color de los ojos azules y marrones.

Se han realizado estudios que examinan la frecuencia de alelos específicos de repetición en tándem corto en grupos de distinta ascendencia geográfica. Esta investigación ha dado como resultado la posibilidad de establecer una ascendencia probable debido a que ciertos alelos son más probables en grupos específicos. Sin embargo, este uso particular del análisis de ADN no es infalible y sólo puede utilizarse como una estimación. El Servicio de Ciencias Forenses ha desarrollado una prueba de inferencia étnica, que proporciona el origen probable de una muestra de ADN de una serie de grupos (europeos blancos, afrocaribeños, de Oriente Medio, del sudeste asiático y subcontinentales indios).

Algunos países y estados están aplicando una legislación específica relativa al uso del análisis fenotípico del ADN. En la actualidad, muchas jurisdicciones sólo permiten el análisis del ADN no codificante, aunque los Países Bajos permiten actualmente el fenotipado forense bajo ciertas normas. El uso fenotípico de los SNP también se ha utilizado en análisis no forenses, como en la determinación de la etnia, el pelo y el color de la piel de restos antiguos.

Sin embargo, este enfoque plantea una serie de problemas y preocupaciones. Es poco probable que unos pocos SNP elegidos proporcionen una «imagen» infalible del origen de la muestra debido a la complejidad de los rasgos multigénicos, así como a factores externos como el entorno y el envejecimiento. Incluso si la técnica se perfeccionara para su uso en la ciencia forense, fenotipos como el color del pelo o de los ojos pueden enmascararse fácilmente mediante tintes y lentes de contacto de color, lo que limita su uso forense. También existen problemas de privacidad relacionados con los posibles rasgos determinados, aunque se ha argumentado que los rasgos visibles, como el color del pelo y de los ojos, no pueden considerarse privados. Sin embargo, si se produjeran nuevos avances hasta el punto de localizar genes para rasgos como la agresividad y la predisposición a ciertas enfermedades, surgirían preocupaciones más serias sobre la sensibilidad de dicha información.

Los investigadores prevén que otros avances podrían permitir averiguar detalles adicionales, como la probabilidad de que el individuo fume, junto con la posibilidad de genes para rasgos como la lateralidad, la agresividad y la homosexualidad.

Análisis del cromosoma Y

Gran parte de los perfiles de ADN modernos se basan en el análisis de las repeticiones cortas en tándem que se encuentran en los autosomas. Sin embargo, una rama particular del análisis de ADN se centra en el marcador amelogenina, el único marcador del cromosoma sexual, útil en el análisis del cromosoma Y. El cromosoma Y, que por lo general sólo se encuentra en los hombres, es un cromosoma pequeño que, a diferencia de otros genes, sólo se altera por la infrecuente aparición de mutaciones. Sin embargo, al igual que el ADN mitocondrial (que se hereda por vía materna), la combinación de alelos en este caso es teóricamente idéntica entre padre e hijo, suponiendo que no se produzca una mutación. Además, la discriminación del análisis del cromosoma Y es comparativamente baja. El análisis del cromosoma Y es especialmente útil en los casos de agresión sexual y violación en los que pueden encontrarse perfiles de ADN mixtos. Se han desarrollado numerosos sistemas para analizar algunos de los STR presentes en este cromosoma, como el Yfiler de Applied Biosystems.

Bases de datos de ADN

Numerosos países han creado bases de datos informatizadas que contienen perfiles de ADN para facilitar la comparación de las huellas de ADN y la identificación de sospechosos y víctimas. La primera base de datos gubernamental de ADN se creó en el Reino Unido en abril de 1995, conocida como la Base de Datos Nacional de ADN (NDNAD). En 2011, había más de 5,5 millones de perfiles de personas en el sistema. Del mismo modo, el FBI de EE.UU. creó su propia base de datos de ADN, el Sistema Combinado de Índices de ADN (CODIS), en 1994, aunque no se implantó en todos los estados hasta 1998. Los miembros del personal que participan en la manipulación y el análisis de las pruebas también suelen enviar sus perfiles de ADN a la base de datos en caso de contaminación accidental. Existe la posibilidad de que las bases de datos de ADN se compartan entre países, aunque algunos países se centran en diferentes loci en la toma de huellas de ADN.

Las bases de datos de ADN no sólo se utilizan para realizar coincidencias directas entre las huellas de ADN de una persona, sino también para realizar búsquedas familiares. Esto implica la búsqueda de coincidencias genéticas entre una víctima/sospechoso y un miembro de su familia cuyo perfil de ADN esté almacenado. Esta técnica se basa en el principio de que es probable que los individuos emparentados presenten similitudes en sus perfiles de ADN. El primer uso destacado de la búsqueda familiar se produjo en el caso del asesino en serie británico Joseph Kappen, que fue detenido después de que se obtuviera el perfil de ADN de su hijo y se relacionara con él.

La creación de bases de datos de ADN ha permitido una aprehensión más rápida de los sospechosos mediante la comparación de nuevas muestras de la escena del crimen con las ya almacenadas en la base de datos, proporcionando vínculos entre los delincuentes y otros delitos. También se ha utilizado ampliamente en casos sin resolver, demostrando en algunos casos la culpabilidad de un individuo décadas después de haber cometido el delito. A la inversa, personas encarceladas por error han sido exoneradas gracias a la aparición de nuevas técnicas de análisis de ADN y bases de datos. También existe el beneficio potencial de identificar cuerpos que han sido demasiado dañados o descompuestos para ser identificados, siempre y cuando se almacene el perfil de ADN del individuo.

Sin embargo, a pesar de las ventajas de estos bancos de datos, ha habido una importante controversia en relación con el tema. La práctica habitual en muchos lugares es tomar una muestra de ADN de un individuo cuando se le detiene, pero esto plantea la duda de si su ADN debe conservarse si luego se le declara inocente. También preocupa el hecho de que se identifique a personas inocentes como coincidentes o parcialmente coincidentes con el ADN encontrado en el lugar del delito, aunque no hayan participado en él, sino que hayan acudido inocentemente al lugar en otro momento. Este problema concreto es cada vez más preocupante a medida que las técnicas de toma de huellas de ADN se vuelven más sensibles. También existe la preocupación por la privacidad en cuanto a la disponibilidad de información genética sensible, como la susceptibilidad a ciertas enfermedades y las relaciones familiares. Una desventaja más administrativa de este tipo de bases de datos está relacionada con la necesidad de contar con una instalación lo suficientemente grande como para almacenar estos datos, pero también con la seguridad adecuada, una combinación que puede resultar extremadamente cara.

Interpretación del perfil de ADN

El objetivo principal del análisis forense del ADN es obtener una «huella» de ADN a partir de una muestra biológica y compararla con los perfiles obtenidos a partir del ADN del lugar del delito, de una persona o de los perfiles almacenados en una base de datos. El proceso del perfil de ADN moderno incluye la determinación estadística de la probabilidad de que dos personas compartan el mismo perfil, estableciendo lo común que es un genotipo o una colección de genotipos dentro de una población. Cuantos más loci se estudien y mayor sea la heterocigosidad de estos loci, menor será la probabilidad de que dos personas compartan un mismo perfil. Sin embargo, estas cifras sólo pueden ser estimaciones y no tienen en cuenta ciertos factores, como los parientes biológicos. Las pruebas de ADN suelen presentarse en términos de probabilidad de coincidencia aleatoria, en lugar de afirmar definitivamente si dos perfiles coinciden o no.

Fuente
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